實(shí)驗(yàn)室電鏡搬運(yùn)機(jī)殼安裝的亞瑟觀察到賽默飛將于5月25日-28日每天下午2-3點(diǎn)鐘，帶來一場關(guān)于冷凍電鏡在針對棘手靶點(diǎn)的藥物設(shè)計(jì)中的應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)研討會(huì)。在本次網(wǎng)絡(luò)研討會(huì)上，來自莫納什大學(xué)的 Patrick Sexton 教授、默克集團(tuán)的 Corey Strickland 博士、薛定諤公司的 Kenneth Borelli 博士和基因泰克公司的 Lionel Rougé 博士等主講人將帶來發(fā)人深思的精彩演講，隨后觀眾可以圍繞演講主題進(jìn)行線上提問與探討。冷凍電鏡已經(jīng)成為藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)中不可或缺的技術(shù)。在對復(fù)雜靶點(diǎn)進(jìn)行基于結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)以及對疫苗和藥物配方進(jìn)行直接成像上，冷凍電鏡是一個(gè)強(qiáng)大的技術(shù)手段。在本次演講中，我將向大家介紹，在大型制藥公司中，冷凍電鏡是如何實(shí)現(xiàn)從無到有建立的。我將介紹我們在開發(fā)商業(yè)案例、建造、安裝以及當(dāng)前發(fā)展方面的經(jīng)驗(yàn)。在這個(gè)過程中，我們遇到了很多意想不到的狀況，相信這些經(jīng)驗(yàn)可以幫助到那些對冷凍電鏡感興趣的聽眾。哺乳動(dòng)物瞬時(shí)受體電位 (TRP) 通道通過介導(dǎo) Ca2+ 跨膜對物理和化學(xué)環(huán)境刺激的反應(yīng)來控制細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。TRPA1 因其在疼痛和神經(jīng)源性炎癥中所起到的作用，一直都備受制藥業(yè)關(guān)注。它主要通過初級(jí)傳入痛感感受器來表達(dá)，并通過保守的半胱氨酸和賴氨酸殘基的共價(jià)修飾檢測各種化合物。由于其治療價(jià)值，我們啟動(dòng)了一個(gè)內(nèi)部項(xiàng)目，以確定特定的 TRPA1 抑制劑：我們從中發(fā)現(xiàn)了多種有趣的化學(xué)型。為了指導(dǎo)這些分子的優(yōu)化過程，我們根據(jù)先前發(fā)表的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，通過使 TRPA1 結(jié)構(gòu)來進(jìn)行基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì) (Paulsen et al.，Nature，2015)。蛋白質(zhì)工程、生物化學(xué)和冷凍電鏡方法的結(jié)合構(gòu)建了一個(gè)強(qiáng)大的系統(tǒng)（例如更高的分辨率、高重現(xiàn)性），使我們得以確定一個(gè)新的結(jié)合位點(diǎn)，并對具有改進(jìn)特性的分子進(jìn)行優(yōu)化。由于精‌密‍設(shè)‌備‍搬‌運(yùn)‍實(shí)驗(yàn)中的背景噪音和蛋白-配體結(jié)合的動(dòng)態(tài)性質(zhì)，從冷凍電鏡產(chǎn)生的數(shù)據(jù)中獲取一個(gè)準(zhǔn)確的蛋白-配體相互作用的原子模型往往是一大挑戰(zhàn)。為了解決這個(gè)問題，我們將已有的計(jì)算建模技術(shù)與電鏡圖勢結(jié)合起來，從而創(chuàng)建準(zhǔn)確性和有效性更強(qiáng)的蛋白-配體結(jié)合的結(jié)構(gòu)模型，并將它們納入到啟用冷凍電鏡的、基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)管線中。該管線已經(jīng)過回顧性研究和藥物發(fā)現(xiàn)方案應(yīng)用的驗(yàn)證。這里，我們將介紹采用盲法所進(jìn)行的由基因到藥物的研發(fā)管線，該項(xiàng)目的建立得益于薛定諤公司與賽默飛世爾科技公司的戰(zhàn)略合作關(guān)系。我們采用了 GeneArt® 基因轉(zhuǎn)蛋白技術(shù)獲得了濃度為 5mg/ml 的高蛋白，并使用賽默飛世爾科技公司的 iSPA 工作流程來解析蛋白-配體復(fù)雜結(jié)構(gòu)，分辨率為 2.6Å。薛定諤公司藥物發(fā)現(xiàn)平臺(tái)利用這些結(jié)構(gòu)創(chuàng)建了一個(gè)經(jīng)過驗(yàn)證的、基于結(jié)構(gòu)的同源配體結(jié)合親和力模型，能夠準(zhǔn)確地從一組 62 個(gè)已獲得專利的配體中分離出強(qiáng)結(jié)合分子 (<100nM)、中等結(jié)合分子 (100nM-1uM) 和弱結(jié)合分子 (<1uM)，準(zhǔn)確率達(dá)到 73%。整個(gè)工作流程──從基因開始到實(shí)現(xiàn)經(jīng)過驗(yàn)證的、可指導(dǎo)合成決策的親和力模型──在幾個(gè)月內(nèi)完成。G 蛋白偶聯(lián)受體 (GPCR) 包含細(xì)胞表面受體家族，是一類主要的治療物靶點(diǎn)。單顆粒冷凍電鏡技術(shù)的進(jìn)展使其能夠應(yīng)用于確定 G 蛋白偶聯(lián)受體結(jié)構(gòu)，特別是活性狀態(tài)的受體與其經(jīng)典轉(zhuǎn)導(dǎo)物（異源三聚體 G 蛋白）的復(fù)合體，精‌密‍設(shè)‌備‍搬‌運(yùn)‍這些受體對于應(yīng)用 X 射線晶體學(xué)方法而言是一大難題。冷凍電鏡可以應(yīng)用于修飾的 G 蛋白偶聯(lián)受體，并且有更多手段來穩(wěn)定活性狀態(tài)的復(fù)合體，包括納米抗體、抗體片段和修飾的 G 蛋白。良好復(fù)合體可常規(guī)實(shí)現(xiàn)優(yōu)于2.5Å 的分辨率，使配體的位置準(zhǔn)確，并精細(xì)化顯示關(guān)鍵的水網(wǎng)絡(luò)。新的技術(shù)手段目前處于開發(fā)階段，目的是使較小的、與抑制劑結(jié)合的受體成像，預(yù)計(jì)在不久的將來會(huì)擴(kuò)大冷凍電鏡在 G 蛋白偶聯(lián)受體結(jié)構(gòu)測定中的常規(guī)應(yīng)用。此外，工作流程的簡化，以及在裝備有直接電子探測器的 200kV 儀器上成像，使冷凍電鏡能夠以較低的成本支持藥物化學(xué)所需的研究周期。